ПЦР-диагностика (полимеразная цепная реакция)

Для успешного лечения самым важным моментом является быстрая и безошибочная диагностика. В последнее время перечень методик и возможностей диагностических центров, поликлиник и больниц в сфере диагностирования постоянно расширяется. После появления относительно новой методики — ПЦР-анализа, этот метод быстро завоевал приверженцев среди медицинских работников, поскольку часто является незаменимым при выявлении инфекционных заболеваний.

Сфера применения метода, основанного на полимеразной цепной реакции, не ограничивается медициной, но самое большое распространение ПЦР-диагностика получила для выявления различных болезней.

Преимущества и недостатки

За широкий перечень преимуществ автор методики получил Нобелевскую премию, как подтверждение признания специалистов универсальности и высоких возможностей такого способа диагностики.

К неоспоримым достоинствам ПЦР можно отнести следующие:

• Очень высокая чувствительность. Обычно говорят о чувствительности от 95 до 100%, но это усредненные данные. Этот показатель отличается для разных микроорганизмов. Так, для гепатита С он не бывает ниже 97% (при условии выполнения всех требований), а для определения уреаплазмоза — не менее 99%. Такая чувствительность является самой высокой на данный момент, поэтому способ почти не имеет конкурентов по этой характеристике.
• Возможность применения на самых ранних стадиях. В то время, когда другие методы диагностики еще не способны выявить возбудителя из-за его малого количества в образце пробы, ПЦР уже выдает корректный результат. Обнаружить присутствие возбудителя можно даже при наличии единственного экземпляра, а в некоторых случаях — только фрагмента микроба. По этой причине способ применяется и при хронических или скрытых течениях патологий, а также в стадии инкубации.
• Широкий спектр результатов. Анализ способен выявить одновременно несколько возбудителей, для этого не понадобится проводить повторные манипуляции. Иногда удается найти возбудителей, которые даже не предполагались при первичной диагностике.
• Универсальность образцов. В качестве пробы могут быть представлены образцы крови, слюны, мокроты, волосы, выделения из влагалища, клетки разных тканей.
• Скорость получения результатов. В большинстве случаев ответ получают через 5-6 часов. Для культурального анализа, приближающегося к полимеразной цепной реакции в плане точности, такой же результат можно получить в срок от нескольких дней до пары недель.
• Количественное определение возбудителя. Этот параметр позволяет определять титр микробов в материале, а это свойство часто необходимо для оценки эффективности выбранной тактики лечения.
• Выявление самого микроорганизма, а не определение его реакций. Большинство анализов основаны на ответной реакции возбудителя на химические реактивы, окрашивание и т. д. Этот способ диагностики позволяет обнаруживать непосредственно микроб, а не косвенные признаки, антитела и т. п.

Несмотря на такой широкий перечень преимуществ, у метода есть и некоторые недостатки:

• Из-за загрязнения пробы предыдущим образцом может произойти ложное выявление микроорганизмов. Такое происходит при загрязнении инструментов или реактивов, участвующих в ходе анализа. Даже в воздухе присутствуют фрагменты микробов, способных отразится на результате, поэтому в таких лабораториях обязательно должен быть установлен биологический фильтр с максимальной степенью очистки воздуха.
• Ложноотрицательный результат. Даже при всех явных проявлениях болезни иногда получают отрицательные данные. Причина этого – в неверно выбранном месте для взятия образца, поэтому персонал лаборатории должен обладать достаточной квалификацией, знаниями и опытом.
• Оценка данных должна производиться исключительно лечащим врачом, потому что интерпретация результатов ПЦР-анализа — сложный процесс. Наличие положительного ответа не всегда означает болезнь. Дело в том, что после того, как заболевание успешно пролечено, фрагменты возбудителя долго присутствуют в крови, поэтому заключение может сделать только очень квалифицированный специалист.
• Высокая стоимость диагностики с применением полимеразной цепной реакции. Цена обусловлена дорогостоящим оборудованием и высокими требованиями к условиям лабораторий и квалификации персонала.

Обязательные условия для получения точных данных в ПЦР-лабораториях:

• корректный механизм забора проб и их правильная транспортировка в лабораторию;
• точное соблюдение методик в ходе выполнения анализа;
• высокая стерильность и максимальная автоматизация процесса;
• использование одноразовых инструментов;
• система внутрилабораторного контроля для подтверждения достоверности данных.

При условии выдерживания всех требований на основе данных, полученных при помощи методики ПЦР, можно не только определить болезнь, но сделать прогноз ее течения и составить алгоритм лечения.

Суть метода

Полимеразная цепная реакция позволяет быстро скопировать и воспроизвести ДНК-цепочки микроба, который вызвал заболевание. Для того, чтобы процесс шел быстро, используют специальные ферментные препараты, ускоряющие репликацию и постройку цепочки нуклеотидов.

После того, как процедура происходит в полном объеме, присутствие в пробе возбудителя увеличивается в миллионы раз, после чего его выявление и идентификация не составляют проблемы.

Лаборант может сравнить полученный образец с представленными в базе данных и безошибочно назвать его, а также определить его исходное количество.

Кроме того, методика позволяет клонировать отдельные участки цепи ДНК, вызывать в них необходимые мутации, объединять и комбинировать участки между собой.

Сферы применения

Самое большое распространения ПЦР-диагностика получила в медицине. С помощью нее можно определить вирусные, инфекционные, наследственные болезни, причем сделать это можно не только в активной фазе, но и сразу после заражения.

Области медицины, в которых метод ПЦР активно используется для диагностики:

• урология и гинекология — для обнаружения большинства венерических заболеваний (уреаплазмоз, герпес, сифилис, гонорея, гарднереллез, трихомониаз, хламидиоз, ВИЧ, микоплазмоз, папилломавирус человека, кандидоз и пр.);
• пульмонология — при туберкулезе или пневмониях бактериальной или вирусной природы;
• гастроэнтерология — при хеликобактериозе;
• в гематологии — при цитомегаловирусе, различных онковирусах крови;
• в области инфекционных болезней — для выявления дифтерии, сальмонеллеза, мононуклеоза, листериоза, гепатитов вирусного происхождения, энцефалита;
• в онкологии — для определения рака груди, лейкемии, лимфомы.

Этот метод применяют и в неонатологии, педиатрии, офтальмологии, неврологии — практически в любой отрасли медицины он оказался необходим.

На видео подробно рассказано, какие инфекции можно выявить с помощью  полимеразной цепной реакции.

Большинство заболеваний, передающихся половым путем, быстро и успешно диагностируются именно благодаря ПЦР-диагностике. Кроме определения возбудителя, этот метод позволяет узнать конкретный штамм микроорганизма, что делает возможным выбор наиболее действенного препарата при лечении.

Помимо медицины способ ПЦР используется и в других сферах:

• Криминалистика и судебная медицина — помогает установить личность преступника посредством сравнения генетического материала подозреваемого человека с образцами, найденными на месте совершения преступления.
• Установление отцовства — сравниваются размноженные генетические наборы родителя и ребенка, находятся идентичные фрагменты, на основании чего можно судить о степени их родства.
• Наука использует методику в ходе экспериментов, применяя генные мутации, устанавливая родство эволюционных веток отдельных организмов и т.д.

ПЦР-диагностика в венерологии

Многие инфекции, вызывающие венерические болезни, на начальных стадиях очень сходны по проявлениям и симптоматике, поэтому дифференцировать их достаточно сложно. В то же время раннее определение инфекционного агента позволяет начать лечение как можно раньше и сократить время лечения до минимума, избежав развития возможных осложнений.

Полимеразная цепная реакция — эффективный механизм для определения таких групп заболеваний половой сферы:

• бактериальные инфекции (сифилис, донованоз, гонорея, хламидиоз и пр.);
• вирусные патологии (папилломатоз, кондиломатоз, ВИЧ, половой герпес и т.д.);
• грибки (молочница, баланопостит и пр.)

В дерматовенерологии особенно полезно свойство данной методики находить инфекционных агентов в периоды ремиссий или при носительстве, когда человек может заражать партнеров, не имея при этом симптомов болезни.

Ход анализа полимеразной цепной реакции

Анализ ПЦР происходит в 4 основных этапа:

• подготовка материала к копированию;
• объединение фрагмента ДНК и праймера;
• копирование генетического набора исследуемого материала;
• идентификация и оценка полученного ДНК-набора.

Этап 1

Образец подогревают до температуры 94-98°C в специальном приборе — амплификаторе, который программируется на выдерживание точных температур с низкой погрешностью. Заданная температура держится на протяжении минуты-двух. Это необходимо для денатурации ДНК, чтобы двойная спираль разошлась на две отдельные цепочки.

Этап 2

Температура в амплификаторе понижается до 72-75°C для того, чтобы праймер смог распознать сходный с ним участок ДНК-цепи и объединиться с ним.

Праймеры — это специальные реагенты, которые подходят только к одному виду возбудителя. Если необходимо провести анализ на несколько патогенов, то в образец добавляют необходимое количество праймеров.

На этой стадии ДНК реплицирует свою матрицу, используя праймер.

Возможности лаборатории ограничены наличием праймеров для определенных микроорганизмов, поэтому диапазон возможностей определяется наличием таких образцов.

Этап 3

В этом отрезке происходит увеличение генетического материала возбудителя. К праймеру с матрицей приближается фермент и воспроизводит новую цепь ДНК, идентичную той, которая содержалась в первоначальной цепочке.

Когда синтез окончен, завершается один полный цикл полимеразной цепной реакции. По времени он продолжается в среднем до 3 минут. За это время происходит удваивание материала. Дальнейшее увеличение количества цепочек происходит в геометрической прогрессии, и к окончанию анализа успевает пройти 50-80 циклов.

Этап 4

Этап, требующий внимательности и особой тщательности со стороны персонала.

Определение микроорганизма происходит с использованием электрофореза или меток, наносимых окраской. При использовании электрофореза определяющим моментом становится длина фрагментов ДНК, а при использовании меток — развитие окраски в ходе ферментативной реакции.

Разновидности ПЦР-анализов

Вариаций такой ПЦР диагностики существует много. Выбор определенного метода зависит от многих факторов: предположительного диагноза, возможностей доступных лабораторий, метода взятия материала и пр.

Наиболее часто используются такие разновидности ПЦР:

• вложенная;
• ступенчатая;
• с горячим стартом;
• виртуальная;
• ассиметричная;
• в реальном времени и т. д.

Преимущественно используют ПЦР в реальном времени, так как способ характеризуется самыми точными результатами и максимальной скоростью обработки данных. После его применения заключение готово через час-два.

Метод широко используется в педиатрии для выявления вирусов и инфекций крови, генетических заболеваний, TORCH-инфекций. Неонатологи назначают такую диагностику в проблемных случаях буквально с первых дней жизни. Иногда подобная диагностика позволяет обнаружить инфицирование внутриутробных вод, составляющих опасность для развития плода в период активного формирования.

Если врач выдает направление на обследование с применением полимеразной цепной реакции, то он должен уточнить, какой именно биоматериал необходимо предоставить пациенту и каким образом подготовиться к отбору пробы.

Анализ крови

Кровь в качестве биоматериала для тестирования берут при подозрении на ВИЧ, вирусный гепатит, токсоплазмы, половой герпес и цитомегалию. Для большинства этих патогенов до использования этого метода диагностика базировалась на выявлении антител к возбудителю, что сильно затягивало время обнаружения микробов в тот период, когда антитела еще не вырабатываются.

Перед сдачей крови для диагностики в данном случае не нужны особые приготовления, но лучше, если проба будет отобрана натощак. Единственное обстоятельство, способное серьезно исказить результаты — прием антибиотиков, поэтому сдаче должен предшествовать временной отрезок после приема подобных лекарств в несколько дней или недель в зависимости от типа антибиотика.

В самых современных клиниках в последнее время для отбора крови на ПЦР используют вакуумные системы, которые минимально повреждают кожные покровы и сводят к минимуму вероятность попадания в пробу загрязняющих агентов из воздуха, инструментов или рук лаборантов.

Анализ мазка

Используется как в гинекологии, так и в венерологии для определения заболеваний, передающихся половым путем. Часто назначают ПЦР мазка во время беременности для выявления скрытых факторов, способных негативно повлиять на формирование плода или ход беременности.

Подготовка к отбору материала заключается в том, чтобы полностью исключить половые контакты за несколько суток до процедуры. Проводить спринцевания марганцовкой или настоями трав тоже нельзя. На протяжении критических дней и 2-х дней после них мазок на ПЦР-анализ не берется.

Отбор биоматериала производят в лаборатории из влагалища, шейки матки, цервикального канала или уретры.

ПЦР-анализ мазка позволяет выявить патоген, который устойчив к определенному виду антибиотиков. Кроме того, показаниями к такому виду диагностического обследования выступают:

• осложненная беременность без видимых причин;
• острое течение венерической болезни;
• предположительное хроническое течение венерического заболевания;
• выявление причин бесплодия или самопроизвольных абортов.

Анализ кала

Анализ кала с применением полимеразной цепной реакции назначается специалистом для уточнения наличия инфекции. Подготовка к отбору пробы кала для ПЦР заключается в следующем:

• исключить за несколько суток слабительные средства в виде любых свечей, масел или оральных медикаментов;
• не употреблять накануне лекарства или продукты, которые придают калу выраженную окраску.

Материал для ПЦР-определения лучше всего доставить в специальном контейнере для кала с палочкой. Внутреннее пространство контейнера стерильно, поэтому протирать или промывать его не следует. Во время отбора образца важно отслеживать, чтобы не задеть внутреннюю поверхность приемника, также в пробе не должно быть следов мочи. Перед отбором запрещено применение клизм.

Анализ мочи

Такое исследование с помощью ПЦР позволяет извлечь ДНК образец вируса или бактерии. Забор мочи лучше проводить утром натощак. Лучше всего, если это будет происходить непосредственно в лаборатории.

Обязательные условия подготовки для получения результатов исследования мочи в лаборатории полимеразной цепной реакции:

• выдержать 3 недели после приема антибиотиков;
• перед отбором жидкости не пить и не есть;
• запрет вагинального секса за сутки до сдачи пробы;
• в контейнер нужно поместить первую порцию материала после пробуждения.

Интерпретация результатов

Расшифровку результатов диагностики проводит специалист, направивший пациента на ПЦР-исследование. В протоколе, выданном лабораторией, может фигурировать отрицательный или положительный результат ПЦР:

• Отрицательный — случай, в котором не обнаружено фрагментов возбудителя предполагаемой болезни, то есть человек здоров и не перенес этого заболевания в недавнем времени.
• Положительный — в пробе обнаружены РНК или ДНК патогена и человек нуждается в лечении.

Самостоятельно трактовать полученные данные не стоит, так как возрастные нормы могут значительно отличаться, а различные титры — свидетельствовать о совершенно разных стадиях болезни и подходах к терапии.

Вооружившись результатами ПЦР-диагностики, врачу будет легко определить перечень необходимых мер лечения.

Точность ПЦР-диагностики сделала эту методику незаменимой в диагностировании огромного перечня заболеваний и позволила эффективнее выявлять и ликвидировать патогенные процессы, происходящие в организме человека.

(Пока оценок нет)

Загрузка...